参萸明目合剂对糖尿病大鼠玻璃体及视网膜CTGF表达的影响

  [摘 要]目的 探讨参萸明目合剂对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)大鼠的血糖、血脂和玻璃体CTGF含量及视网膜CTGF的表达的影响及其作用机理。方法 用链脲佐菌素制备糖尿病模型。治疗组给予参萸明目合剂，对照组给予轻苯磺酸钙灌胃，观察大鼠全身情况，称量体重、检测血糖、血脂和玻璃体CTGF含量及视网膜CTGF的表达，并进行视网膜切片免疫组织化学染色。结果 参萸明目合剂可明显改善DR大鼠的生存状况，降低DR大鼠血糖、血脂并可降低大鼠玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达，对实验性糖尿病视网膜病变有一定防治作用。结论 参萸明目合剂能有效的保护视网膜微血管，降低毛细血管的通透性，防止视网膜病变向增殖期进展。
[关键词]非增生型糖尿视网膜病变；参萸明目合剂；SD大鼠

[Abstract] Objective To investigate the influence of Shenyu Mingmu Heji（参萸明目合剂） on diabetic retinopathy (diabetic retinopathy, DR) rats blood glucose, blood lipid and vitreous CTGF content and the expression of on retinal CTGF effect and its mechanism of action. Method Use streptozotocin induced diabetic model. The treatment group was given Shenyu Mingmu Heji（参萸明目合剂）, the control group was given calcium dobesilate orally. To observe the general expression of rats, weighing, blood glucose, lipid and CTGF in vitreous and retinal CTGF content and Conduct immunohistochemical staining and retinal slice. Result Shenyu Mingmu Heji（参萸明目合剂） can obviously improve the DR rat survival condition. This medicine can reduce the blood sugar and blood lipid of DR rats , reduce the content of vitreous and the positive expression of retinal CTGF. There is a certain preventive effect on experimental diabetic retinopathy .Conclusion Shenyu Mingmu Heji（参萸明目合剂）can protect the retina effective microvascular, reduce capillary permeability, prevent retinopathy progressed to proliferative phase.
[Key words]Non proliferative diabetic retinopathy ；Shenyu Mingmu Heji； SD rats

结缔组织生长因子（CTGF）为一种新近发现的主要致纤维化因子。CTGF广泛存在于人类多种组织器官中，它具有促进血管生成、调节内皮细胞、诱导细胞凋亡，促进有丝分裂和细胞增生，趋化细胞等作用。糖尿病性视网膜病变与视网膜成纤维细胞增生、组织纤维化密切相关。近年来的研究显示CTGF参与了糖尿病视网膜病变的发病机制。糖尿病视网膜病变患者玻璃体中该种因子含量随病程延长而增多[1]。
由此我们认为糖尿病视网膜病变发展至后期成为增生性糖尿病视网膜病变时，其纤维增殖膜的形成可能与CTGF相关，抑制CTGF的产生或表达，有益于控制糖尿病视网膜病变的发展。
CTGF为一种新近发现的主要致纤维化因子。CTGF广泛存在于人类多种组织器官中，它具有促进血管生成、调节内皮细胞、诱导细胞凋亡，促进有丝分裂和细胞增生，趋化细胞等作用。近年来的研究显示CTGF参与了糖尿病视网膜病变的发病机制。糖尿病视网膜病变患者玻璃体中该种因子含量随病程延长而增多。
材料与方法
1．糖尿病动物模型建立
由山东大学实验动物中心提供二级SD大鼠70只（140眼)。均为雄性，体重（250士10g），许可证号SCXK(鲁)20090001。经裂隙灯及直接检眼镜检查结果为屈光间质清，眼底无异常者纳入本实验。从70只（140眼)SD大鼠中，随机选取57只大鼠，禁食12h后，将链脲佐菌素(美国Sigma公司)以0.1mol/L、pH=4.5的柠檬酸缓冲液溶解配制成2%溶液，以60mg/Kg体重行一次性腹腔注射48h后经尾静脉取血测量大鼠空腹血糖，空腹血糖>16.7mmol/L，尿糖>+++，为造模成功[2] 。
2.分组
糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组（简称模型组）15只，参萸明目合剂组（简称治疗组）15只，羟苯磺酸钙（简称对照组）15只。正常组大鼠13只。实验过程中模型组死亡3只，故实际观察模型组大鼠12只。
3实验方法
正常组：不造模，正常喂养，自由饮水。
模型组：造模成功后，按给药组等量生理盐水灌胃，每日1次,持续10周。
对照组：造模成功后，选用对照药物羟苯磺酸钙灌胃，给药剂量为0.5g/kg体重/日（正常成人剂量的20倍）[3]。具体方法为羟苯磺酸钙胶囊用蒸馏水配成100mg/ml的药物溶液，每周配制一次，保存在4℃冰箱。每日灌胃1次，持续10周。
治疗组：造模成功后，选用参萸明目合剂灌胃，给药剂量为0.5g/kg体重/日（正常成人剂量的20倍）[3]，每日灌胃1次，持续10周。
4 组织学处理
糖尿病大鼠成模10周时，100g/L水合氯醛按 0.35ml/100g腹腔注射全身麻醉后，0.5%的盐酸奥布卡因滴眼表面麻醉。每只大鼠均取左眼，于颞上象限角膜缘后1.5mm经睫状体平坦处用30G用微量注射器抽取0.03ml玻璃体液，保存于-70℃。用酶联免疫吸附测定法检测CTGF含量。摘除眼球，置于4%多聚甲醛中固定，常规包埋后石蜡切片，酶联免疫吸附测定法检测视网膜CTGF含量。
每只大鼠均取右眼，摘除眼球，球后视神经保留2mm。角膜开窗浸泡于10%中性福尔马林中固定，12h后充分水洗，沿角膜缘环形剪开眼球，去除眼前节、玻璃体，将含视网膜的眼杯浸泡于10%中性福尔马林中再次固定24h，HE染色观察视网膜结构情况。
5 检测指标
（1）成模前后体重、甘油三酯、胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶；定期检测血糖；成模后24h尿蛋白；同时记录饮食、饮水量、精神状态等变化情况。
（2）采用酶联免疫吸附测定试剂盒测定玻璃体CTGF含量
（3）免疫组化方法检测视网膜CTGF阳性表达
（4）HE染色光镜观察视网膜结构
6 统计学处理
统计结果均以均数士标准差表示，应用SPSS10.O软件进行统计分析，包括两组资料之间比较的t检验和相关分析。
结果
1．模型评价
实验期间正常组大鼠生长情况良好，未出现死尸现象；糖尿病模型大鼠共死亡2只(模型组)。
2．不同时间点各组大鼠血糖比较
各组大鼠实验前后血糖变化的两两比较（LSD检验） （表1）
正常组 模型组 对照组 治疗组
（N=13） （N=12） (N=15) (N=15)
成模时血糖 7.12士0.18 21.47±1.07 21.93±0.78 22.13±1.09
4周血糖 7.07士0.36 23.28士0.87 23.25士1.25 23.40士0.94
6周血糖 7.12士0.23 23.37士0.82 23.80士0.59 23.07士0.56
8周血糖 6.65士0.21 24.56士0.39 24.07士0.46 23.20士0.57
10周血糖 7.14士0.24 24.48士0.41 24.15士0.69 22.93士0.63
2.1正常组大鼠血糖值在各时点保持正常而稳定:
2.2各实验组大鼠血糖值各时点均明显高于正常组,差异显著(P<0.05);
2.3各实验组大鼠血糖值在8周内呈进行性增加;
2.4 10周时治疗组血糖增加趋势较对照组低,差异显著(P<0.05)。
3．各组大鼠实验前后体重的比较（±S） 单位：g （表2）
正常组 模型组 对照组 治疗组 P
（N=13） （N=12） (N=15) (N=15)
基础体重 251±5.51 252±4.71 254±3.12 251±4.55 >0.05
实验后体重 411±27.18 334±17.32 339±11.84` 459±7.23 <0.05
体重变化量 150±15 81±17 88±9 109±14 <0.05
表2各组间进行单因素方差分析显示:实验前各组大鼠体重无显著性差异（P>0.05），实验后模型组、对照组的大鼠体重较正常组下降明显（P<0.05）；对照组和模型组大鼠体重无明显差异（P>0.05）；治疗组和模型组及对照组有显著差异P<0.05，说明治疗组好于对照组；对照组与治疗组之间有显著性差异（P<0.05），治疗组体重高于对照组。从均数可以看出，实验前后体重增加量正常组＞治疗组＞对照组＞模型组。
4．参萸明目合剂对糖尿病大鼠血脂代谢紊乱的影响
4.1治疗前后各组甘油三酯 ( mmol/L)比较 （表3）
正常组 模型组 对照组 治疗组
治疗前 0.79±0.11 0.81±0.10 0.81±0.09 0.81±0.09
治疗后 0.83±0.92 1.70±0.52 0.95±0.09 0.92±0.09
正常组、治疗组和对照组之间无明显差异（P>0.05）；模型组和治疗组之间有明显差异P=0.00（P<0.05）；表明参萸明目合剂和羟苯磺酸钙均能明显降低血液中甘油三酯的含量。综上所述，参萸明目合剂和羟苯磺酸钙均有降低血脂的功能。
4.2治疗前后各组总胆固醇 (mmol/L)比较 （表4）
正常组 模型组 对照组 治疗组
治疗前 1.35±0.21 2.97±0.69 2.87±0.42 2.67±0.19
治疗后 1.48±0.09 2.97±0.49 2.92±0.25 2.65±0.15
模型组、对照组、治疗组与正常组有明显差异P=0.00（P<0.05）,正常组胆固醇明显低于其他各组。模型组和对照组无明显差异P=0.618（P>0.05），表明羟苯磺酸钙降低胆固醇含量不明显。治疗组和对照组有明显差异P=0.013（P<0.05），治疗组优于对照组，表明参萸明目合剂能明显降低血液中胆固醇的含量，疗效优于羟苯磺酸钙。综上所述，参萸明目合剂和羟苯磺酸钙均有降低血脂的功能，参萸明目合剂优于羟苯磺酸钙。
5．谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的测定：造模前及成模后夜间禁食12 h，自由饮水，经大鼠腹主动脉采血，分离出血清后用自动血液生化分析仪测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶。
糖尿病大鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量 （表5）
谷丙转氨酶 谷草转氨酶
治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
对照组 55.62土6.79 56.69土4.91 165.39土10.4 166.79土10.5
治疗组 57.07 土2.61 56.44土1.89 163.57土8.87 166.71土8.98
谷丙转氨酶含量治疗组与对照组治疗前后均无明显差异P>0.05；谷草转氨酶含量治疗组与对照组治疗前后均无明显差异P>0.05。表明参萸明目合剂和羟苯磺酸钙治疗期间对大鼠肝功能无损害。
6.各组糖尿病大鼠24h尿蛋白的测定（mg/24h） （表6）
正常组 模型组 对照组 治疗组
尿蛋白 6.33±0.45 42.93±2.43 35.97±1.63 33.92±1.32
对照组、治疗组与模型组相比，24h尿蛋白差异有统计学意义P=0.00（P<0.05），治疗组与对照组均能降低尿蛋白。治疗组与对照组相比，差异有统计学意义P=0.00（P<0.05），参萸明目合剂能降低尿蛋白疗效优于对照组。
7.各组大鼠玻璃体CTGF含量 （pg/mL） （表7）
正常组 模型组 对照组 治疗组
CTGF 211.54±7.27 474.25±7.29 462.20±29.84 353.73±8.17
单因素方差分析，组间CTGF含量差异有统计学意义（P<0.05）,T检验示：模型组、对照组均较正常组CTGF含量升高，差异有统计学意义。治疗组较对照组CTGF含量差异有统计学意义，治疗组优于对照组，表明参萸明目合剂能降低大鼠玻璃体CTGF含量，疗效优于对照组。
8. 各组大鼠视网膜免疫组织化学法CTGF表达的观察
正常组：大鼠视网膜CTGF免疫组织化学染色，显示正常对照组视网膜细胞排列整齐，各层组织无明显异常，神经节细胞层未见CTGF阳性表达细胞。（图1）
模型组：视网膜细胞排列紊乱，神经节细胞层组织水肿，内、外核层细胞间明显水肿、疏松，细胞排列明显紊乱，视网膜明显水肿增厚， CTGF表达呈强阳性，着染呈深棕色，视网膜明显水肿增厚。（图2）
对照组：视网膜细胞排列紊乱，神经节细胞层组织水肿减轻，内、外核层细胞间水肿、疏松，细胞排列明显紊乱， CTGF表达呈阳性，着染呈棕黄色，视网膜明显水肿增厚。（图3）
治疗组：视网膜细胞排列较规则，神经节细胞层、内外核层组织水肿明显减轻，CTGF表达呈弱阳性，着染呈浅棕黄色。（图4）
糖尿病大鼠中视网膜内CTGF表达较正常组明显增加。
9.HE染色光镜下观察结果（×200）
正常组：视网膜结构完整，各层细胞清晰，细胞排列整齐。（图5）
模型组：视网膜内表面不平整，内界膜肿胀明显，表面不平、增厚,有较多视网膜血管内皮细胞突出于内界膜。内外核层水肿，视网膜各层变薄,细胞数量减少且排列紊乱十分明显，部分血管扩张更加明显。（图6）
对照组：视网膜结构不规则，内界膜肿胀减轻，内核层和外核层细胞水肿，排列紊乱，部分血管呈扩张趋势，但未见缺血区及新生血管形成。（图7）
治疗组：视网膜轻微增厚，视网膜内界膜略肿胀，神经节细胞及内核层和外核层细胞排列较整齐。（图8）
讨论
糖尿病视网膜病变是一种慢性进展性疾病，该病发展至后期将产生增殖膜，增殖膜的产生与其早期血管病变、各种细胞生长因子的作用密切相关，如不及时进行干预，随着病程延长，病情将加重，纤维化将发生[4]。
CTGF 是一种新近发现的细胞因子, 被视为转化生长因1( TGF1) 的下游效应介质[5],在创伤修复、组织纤维化进程中起重要作用。近期国外有人认为血管内皮生长因子和CTGF是PDR发生的2个最关键的因子[6]。
正常生理情况下体内的CTGF表达很低或无,但在胚胎发育、骨发育过程中可有CTGF的一过性表达增高。在病理情况下,如进行性系统性硬化症、动脉粥样硬化、肿瘤、糖尿病、器官纤维化、创伤等情况下,成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、上皮细胞、软骨细胞和部分肿瘤细胞等多种细胞均可以产生CTGF。CTGF在DR发生的前期对视网膜病变的发生发展均具有一定的促进作用。国外的研究发现DR患者玻璃体中CTGF的浓度升高, 导致新生血管形成更活跃[7]。CTGF促进新生血管形成及纤维化的机制可能是促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质的合成[8]有关。CTGF在 PDR的发生过程中起着一定的作用, 可能促进眼新生血管形成及纤维化有关[9]。
1．视网膜CTGF阳性表达与玻璃体CTGF含量的分析
本研究中，各组大鼠视网膜CTGF免疫组化染色结果显示：正常组大鼠视网膜细胞排列整齐，各层组织无明显异常，神经节细胞层未见CTGF阳性细胞；治疗组细胞排列较规则，CTGF的阳性表达及视网膜水肿情况明显好于对照组和模型组。各组大鼠玻璃体CTGF含量：正常眼玻璃体中CTGF含量较低平均为211.54±7.27, 模型组为474.25±7.29，对照组为462.20±29.84，治疗组为353.73±8.17 。本研究显示, 生理状态下玻璃体内存在一定量的 CTGF，治疗组明显低于对照组和模型组。
我们的实验显示，随着糖尿病视网膜病变的病程的进展，玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达呈上升趋势，与国内同类研究一致[10]；参萸明目合剂治疗后的糖尿病大鼠玻璃体CTGF含量及视网膜CTGF的阳性表达均明显降低。由此可见参萸明目合剂可降低玻璃体CTGF含量和视网膜CTGF的阳性表达，降低PDR的发生。尽管DR发展过程中CTGF并非唯一的致纤维化因素,但其作用不容忽视,我们认为参萸明目合剂对DR具有一定治疗作用，可延缓DR病情的发展，抑制PDR发生。其机理可能与抑制细胞有丝分裂和增生，抑制DR新生血管的形成和纤维化有关。
2．HE染色结果分析
正常组视网膜结构完整，各层细胞清晰、排列整齐，内界膜表面平整无肿胀，血管无扩张，无新生血管；治疗组较模型组和对照组视网膜结构规则，各层排列整齐，细胞水肿明显减轻。未见血管扩张、新生血管及缺血区。
本实验结果显示，参萸明目合剂对STZ糖尿病大鼠视网膜具有保护作用，可减轻视网膜各层水肿，阻断视网膜新生血管生长，维持视网膜结构整齐，减轻糖尿病对视网膜的损害，抑制糖尿病性视网膜病变的发展。作用机理可能与参萸明目合剂补益脾肾、活血通络，改善视网膜的营养和微循环及减轻视网膜的缺血、缺氧状态有关。
3．一般指标的分析
本实验中，模型组大鼠出现典型的多饮、多食、多尿症状，行动迟缓，毛色晦暗，部分大鼠呈进行性消瘦，体重不增反降，并有3只因血糖过高，机体机能迅速衰竭而死亡。正常组大鼠实验期间，行动活跃，饮食正常，毛色光滑，无多饮、多食、多尿现象，体重增长明显。对照组及治疗组大鼠部分也出现三多一少症状，但较模型组明显减轻，且体重增加量明显高于模型组，这一定程度上说明参萸明目合剂可改善高血糖状态下机体的代谢。
本实验中观察到,成模良好的SD大鼠在饲养的过程中,3个月内血糖值不降反升,证明本实验造模方法可取；尽管血糖值在各时间点是上升的,但具有固本祛瘀通络作用的参萸明目合剂上升的幅度要小于模型组,且P<0.05,差异有统计学意义，说明参萸明目合剂可轻度降血糖；参萸明目合剂和参萸明目合剂均有降低血脂的功能，后者优于羟苯磺酸钙。参萸明目合剂能改善患者眼底，提高视力，减少血栓和毛细血管阻塞的风险，考虑与具有降血脂、降血糖的功效分不开。
对高血糖引起的蛋白尿的测定表明，具有固本祛瘀通络作用的参萸明目合剂能降低STZ糖尿病大鼠尿蛋白，疗效优于羟苯磺酸钙[11]。参萸明目合剂可以减少早期糖尿病肾病尿蛋白的排泄，延缓糖尿病肾病的进展。同时，如果用药剂量合理，参萸明目合剂对大鼠肝功能无损害。
综上所述，参萸明目合剂能降低STZ糖尿病大鼠视网膜VEGF表达，降低大鼠玻璃体CTGF含量，维持视网膜结构的正常，阻止STZ糖尿病大鼠视网膜新生血管生长，降低视网膜纤维化的发生，同时参萸明目合剂能降低血糖、尿蛋白、血脂，维持大鼠的体重，对糖尿病肾病及DR的发展起到抑制作用。

参考文献
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附录
1各组大鼠视网膜免疫组织化学法CTGF染色光镜下观察结果（×400）

图1正常组

图2模型组

图3对照组

图4治疗组

2 各组大鼠HE染色光镜下观察结果（×400）
正常组 图5

模型组 图6
内界膜

对照组 图7
内界膜

治疗组 图8