PUMA蛋白在皮肤鳞状细胞癌中的表达和意义

 【摘　要】　目的:探讨PUMA蛋白在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义。方法: 采用免疫组化SP法观察36例皮肤鳞癌组织和25例正常皮肤组织石蜡标本中PUMA蛋白的表达情况。结果:皮肤鳞状细胞癌（SCC）组织中PUMA蛋白阳性表达率（25.18%）明显低于正常皮肤组织（78.00%）（P < 0.05）；SCC中低分化组的PUMA蛋白的阳性表达率低于高分化组（P<0.05）。结论：PUMA蛋白表达下调可能使细胞恶性转化和增殖。
【关键词】　皮肤鳞状细胞癌（SCC）　PUMA　免疫组化
The Expression and Significance of PUMA protein inCutaneous squamous cell carcinoma
Zhou Shuwei1, Su beibei2,Zhou yong1
(1.Department of Head and Neck Breast Surgery, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang 45300, China；2. Department of dermatology, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang 45300, China)
Abstract: Objective To investigate the expression and significance of PUMA protein in cutaneous squamous cell carcinoma. Methods Expression of PUMA protein was detected in 36 SCC and 25 normal skin specimens by SP immunohistochemical technique. Results The positive rate of PUMA protein was significantly lower in SCC(41.18%) than that in normal skin(100%)(P<0.05); The positive rate of P-ERK was significantly higher in SCC(76.47% ) than that in normal skin (20.00% )(P<0.05); The positive rate of PUMA protein in the low differentiation group were lower than it in the high differentiation group(P<0.05). Conclusion The decrease or deletion of PUMA protein expression will result in the malignant transformation and proliferation.
Key words: cutaneous squamous cell carcinoma; PUMA; Immunohistochemistry
皮肤鳞状细胞癌( cutaneous squamous cell carcinoma, SCC) 是一种常见于头面部的恶性肿瘤，随着社会的发展，其已成为头颈外科及整形外科的一种常见病。PUMA是Yu等[1]于2001年发现的Bcl-2家族BH3-only亚家族中的成员之一，因其可被p53快速诱导并具有强大的促凋亡作用而得名。鉴于其在p53依赖与非依赖途径的细胞凋亡启动和肿瘤发生过程中有重要作用，遂渐成近来研究的热点之一。但目前在皮肤鳞状细胞癌组织中PUMA蛋白的表达情况及与皮肤鳞状细胞癌的病理特征之间的关系鲜见报道。本研究采用免疫组化SP法，通过对PUMA蛋白在SCC及正常皮肤组织中的表达情况进行检测，为探讨它们在SCC发生发展中的意义提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 石蜡组织选用我院病理科2007年3月~20014年6月切除且病理确诊的皮肤鳞状细胞癌组织36例，年龄47～80岁(平均66.4岁)，男20例，女16例；组织学分级：高分化16例、中分化11例、低分化9例；患者无合并皮肤病、结缔组织病、免疫系统疾病及其它重要脏器疾病；患者术前均未进行放疗、化疗、免疫、冷冻、激光等治疗。25例正常皮肤组织（对照组）为我院头颈乳腺科非癌患者术中修剪或行全厚皮移植时经修剪剩余的全厚皮。
1.2 主要试剂 鼠抗人PUMA单克隆抗体（浓缩型）、SP免疫组化试剂盒（浓缩型）均购自北京中杉金桥生物科技公司。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化 采用免疫组化SP法，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行，用PBS液代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照，PUMA蛋白（工作浓度为1:50）染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，主要位于细胞质，部分位于胞膜。
1.3.2 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件对数据进行χ2检验，检验水准α=0.05。
1.3.3判断标准　①根据着色的强弱，染色强弱以多数细胞的呈色反应为准：不着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分。②先在低倍镜下选取细胞分布均匀的视野， 再在高倍镜视野下用CMIAS病理彩色图像分析系统进行图像分析，每张切片计数500个细胞的阳性细胞数，计算出阳性细胞的百分比，用%表示即：阳性细胞率=(阳性细胞数/500)×100%。然后根据阳性细胞百分比记分<10%为0分，10%～45%为1分，46%～70%为2分，>70%为3分。根据上述两项的记分之和将PUMA蛋白结果记为：阴性（-），阳性（+～+++）。

2．结果
2.1 正常皮肤及SCC中PUMA蛋白的表达情况 PUMA蛋白在正常皮肤及SCC中主要表达于细胞质，在正常皮肤组织中的表达阳性率为76.00%，在SCC中的表达阳性率为30.56%，两者差异有统计学意义(P<0.05)。PUMA蛋白的表达与SCC临床病理特征之间的关系见表1。

400× A：PUMA在鳞癌中的阳性表达 B：PUMA在鳞癌中的阴性表达
C：PUMA在正常皮肤中的阳性表达 D：PUMA在正常皮肤中的阴性表达
表1 正常皮肤及SCC组织中PUMA蛋白的表达
临床病理特征 例数 PUMA 阳性率
(%)
- +～+++
组织类别
正常皮肤
皮肤鳞癌
分化程度
高分化
中分化
低分化
25
36

16
11
9
0
20

6
10
9
19
11

10
1
0
76.00
30.56

62.50
9.9
0.00
注：与正常皮肤相比P<0.05；为统计方便，将SCC中低分化组和中分化组进行合并后与高分化组比较，P<0.05。
3讨论
2001年，YU等[1]采用SAGE(sefial analysis gene expression)技术、Nakano[2]用微阵列技术分别从人类成骨细胞样细胞和结肠癌细胞系中分离出了一种新的具有促凋亡作用的p53靶基因，命名为PUMA；同年Han[3]等用酵母双杂交技术在研究人淋巴细胞Bcl-2结合元件时从cDNA文库中分离出来与PUMA序列相同的基因，称为Bbc3（Bcl-2 binding component 3)。PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis，P53上调凋亡调控因子)蛋白是Bcl-2蛋白家族中BH3-only亚家族的一员，仅含一个BH3结构域，定位于线粒体外膜，BH3-only蛋白是介导哺乳动物细胞凋亡反应的基本因子[4]。PUMA蛋白可以被P53快速诱导转录且其编码的蛋白具有强大的促进凋亡作用。有研究表明PUMA在正常和异常细胞的p53依赖与非依赖的凋亡途径及肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用，并且比p53的促凋亡作用更加强大和稳定，因此PUMA在近年肿瘤基因治疗的研究中受到广泛关注[5]。PUMA在多种组织中低表达，在肿瘤组织中的表达更低[1]，在早期卵巢癌中只有43%的卵巢癌细胞PUMA表达强阳性，而p53阳性同时PUMA弱表达的卵巢癌患者具有更短的无病生存期[6]。CG Roberts等[7]发现PUMA蛋白在乳腺癌中为低表达；Karst等[8,9]发现在黑色素瘤中PUMA表达明显降低，并且转移性黑色素瘤较非转移性表达更低；PUMA表达减弱或缺失与淋巴结转移和5年生存率明显相关。相关研究结果还表明PUMA表达缺失还与黑素瘤大小及分期相关。Cheng-Chang Yeh, MS等[10]研究发现人类口腔癌中PUMA的表达阳性率较低，且在人类口腔癌的小鼠模型中，通过PUMA基因的转移治疗可降低肿瘤负荷并延长小鼠的生存期。将携带PUMA的重组脂质体载体转染头颈部鳞癌JHU-012和JHU-013细胞后发现，PUMA可显著抑制癌细胞的克隆[11]。裸鼠移植瘤实验也证实PUMA具有抑制肿瘤生长的作用[12]；薛晓婕等[13]通过免疫组化法发现46例宫颈癌中，PUMA的表达仅13例(32．5％)，有统计学差异(P<0．05)。提示PUMA的低表达可能与肿瘤的发生相关。
吴曙辉等[14]发现在喉鳞状细胞癌组织中PUMA的阳性率为62.5%，显著低于癌旁组织的84.6%；且其阳性表达与喉鳞癌的分化程度、有无区域淋巴结转移及预后显著相关，认为PUMA蛋白的表达与喉鳞状细胞癌的发生、侵袭性和预后有一定关系。本研究显示PUMA在SCC中的阳性率为30.56%，明显低于正常皮肤组的76.00%，其原因可能与肿瘤组织中存在的PUMA基因表达降低或缺失有关。同时，我们的研究也发现中低分化标本中PUMA蛋白的表达（9.9%）较高分化标本中的表达（62.50%）低，且有统计学意义，这可能也是我们与张晓等[15]的不同之处。
总之，本研究通过分析从正常皮肤到SCC组织PUMA蛋白表达阳性率的变化，揭示其可能与皮肤鳞状细胞癌的发生、发展及肿瘤的恶性程度或患者预后相关，有可能作为肿瘤诊断和预后判断的指标之一。皮肤鳞癌为皮肤科常见恶性肿瘤，随着环境的变化，其发病率有进一步升高的趋势，严重威胁患者的健康与生活质量；相关研究提示对PUMA的检测可能有助于SCC的早期诊断，并可能作为治疗SCC的一个新的靶点和预后指标。我们仅用免疫组化法从蛋白水平研究了正常皮肤组织和SCC中PUMA的表达情况，对于该基因的具体调控机制与在肿瘤治疗中的应用等方面的问题有待深入研究。
[参考文献]
[1] Yu J，Zhang L，Hwang PM，et a1．PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells[J]．Mol Cell，2001，7(3)：673-682．
[2] Nakano K，Vousden KH．PUMA，a novel proapoptotic gene，is induced by p53[J]．Molecular Cell，2001，7(3)：683-694．
[3] Han J，Flemington C，Houghton AB，et a1．Expression of bbc3，a pro-apoptotic BH3-only gene，is regulated by diverse cell death and survival signals[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2001,98(20):11318-11323．